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本试剂盒中的EdU试剂含有炔烃，而kFlour647染料试剂含有叠氮化合物。点击法的EdU标记增殖快速有效，易于使用。只需少量的叠氮化染料即可非常有效地标记出整合的EdU。标准化的戊二醛固定和去污剂促渗可以使检测试剂进入细胞，而brdu方法则需要DNA变性(如酸变性、热变性或者用DNase消化)去暴露BrdU，从而方便BrdU抗体结合。

细胞增殖检测是评估细胞健康程度、遗传毒性及抗肿瘤药物效果的基础实验手段。最精确的检测细胞增殖方法是BrdU法。EdU法检测试剂盒是brdu方法的革命性突破。EdU(5-溴-2-脱氧尿嘧啶)试剂盒是一种嘧啶类似物，可以在DNA合成期整合入DNA双链。EdU法检测是基于“点击”反应，一种由铜催化的叠氮化合物和炔烃的原子共价反应。

1. 10mM PBS,pH7.2～7.6
   
2. 固定液(3.7%甲醛in PBS)
   
3. 促渗试剂(10X PBS,1% saponin,0.09% NaN3)
   
4. 1% BSA in PBS，pH7.4
   
5. 去离子水

1. 细胞培养
   细胞培养每孔1×10⁵～3×10⁶细胞接种于6孔板中，培养至正常生长阶段。
   
2. 药物处理(可选)
   客户可以根据实验需要进行各种药物处理。
   
3. 用EdU标记细胞
   注意：EdU的标记浓度应根据所用的细胞类型做相应的优化选择。细胞培养基、细胞生长密度及细胞类型和其他实验条件都有可能影响细胞的标记效果。预实验中，我们建议客户设置一系列的EdU浓度梯度，以确定最佳的合适您的细胞的实验浓度。
   
   1. 以合适的培养基悬浮细胞，加入EdU孵育后，改变温度使细胞生长变慢以更好的有利于EdU整合入细胞内。
      
   2. EdU加入细胞培养基至所需的浓度混匀，推荐客户以10μM的EdU初始浓度进行摸索。细胞培养基、细胞生长密度及细胞类型和其他实验条件都有可能影响细胞的标记效果。预实验中，我们建议客户设置一系列的EdU浓度梯度，以确定最佳的合适您的细胞的实验浓度。阴性对照组不用EdU处理。
      
   3. 合适时间合适条件孵育细胞，EdU孵育细胞的时间可以直接用做测定细胞DNA合成的指标，时间点选择以及孵育时间的长度取决于细胞生长速率。通过短暂的EdU孵育进行的脉冲式标记细胞可以用于研究细胞周期动力学。(注意：EdU浓度与孵育时间相关，短时间孵育(<2h)宜采用高浓度，如：10～50μM，长时间孵育(>24h)宜采用低浓度，如：1～10μM；也可参考附录表2.细胞实验EdU孵育浓度及时间参考)
4. 细胞固定及促渗
   注意①.皂苷促渗液可以用于全血及含红细胞的细胞悬液，以及其他含多种细胞类型的混合细胞悬液的处理。这种促渗液可以在裂解红细胞的同时，维持白细胞的光散射特性。
   注意②.对于需要同时做细胞表面抗原标记的实验，可以考虑在完成EdU孵育后，以含1%BSA-PBS洗涤2次细胞后，在细胞固定促渗之前进行。
   
   1. 以1mL含1%BSA的PBS洗涤细胞1次，收集细胞，去除上清。
      
   2. 以1mL含4%多聚甲醛的PBS重悬细胞，混匀。
      
   3. 室温避光孵育细胞15分钟。
      
   4. 以1mL含1%BSA的PBS洗涤细胞2次，收集细胞去除上清。
      
   5. 以500μL 1×的皂苷促渗液重悬细胞，混匀，孵育20分钟。
5. EdU检测
   注意：对于6孔板收集的细胞样本可参考每个反应需要1mL的反应工作液来进行。用户可以根据自己的样本情况调整等比例减少所用的溶液体积。
   
   1. 制备一份5×的Click-iT EdU反应添加物储液(组份D)：每100mg的D试剂加1mL去离子水至试管中，混匀至全部溶解。使用后，剩余储液存放在≤-20℃，可保存一年，溶液一旦呈现棕色，则说明有效成分降解不能再用。
      
   2. 准备1×Click-iT EdU缓冲液添加物(见表格2)：以去离子水稀释5×储液至1×，溶液应新鲜配制，当天用完。
      
   3. 依据表2准备Click-iT反应混合物。表2要求添加的组份对于反应来说非常重要，否则反应无法有效进行。15分钟内制备Click-iT反应混合物。
      表2．Click-iT反应工作液：
      

      成分	单次反应用量
      PBS,D-PBS,or TBS	875μL
      CuSO4 (组份C)	20μL
      kFlour647-azide (组份B)	5μL
      1×反应缓冲液添加物(E.2步制备)	100μL
      总体积	1mL

   4. 加入1mL的Click-iT反应混合物至每管或每孔，混匀。
      
   5. 避光室温孵育反应混合物30分钟。
      
   6. 以1mL的1×皂苷促渗剂洗涤细胞一次，收集细胞去除上清(接下步骤抗原标记)或以1mL含1%BSA的PBS重悬细胞，上机检测。
      注意：如需同时进行其他标志物检测可参考步骤F.1-F.3。
6. 细胞内抗原标记(可选步骤)
   
   1. 加入所需抗体的孵育工作液，混匀。
      
   2. 避光条件下，以合适的时间和温度进行抗体孵育。
      
   3. 以1mL的1×皂苷促渗液洗涤每管样品，收集细胞，去除上清。
      
   4. 以1%BSA的PBS重悬细胞，上机待检。
7. DNA含量计算(可选)
   
   1. 如有需要，可加入适量RNase至每管，混合。
      
   2. 加入合适的DNA染色液至每管，混匀，避光孵育10～15分钟。
      
   3. 上机待检。
8. 流式分析
   如需在传统流式仪上进行总DNA含量的检测，可采取低流速检测。DNA含量检测所用荧光检测信号应与DNA含量成线性关系。Click-iT EdU标记信号呈现对数放大可以很好的被检测到。
   流式分析。
   EdU检测kFlour647，使用647nm激发器(650/668nm)